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SW480细胞经6小时甲硫氨酸剥夺后再补充甲硫氨酸6小时的甲基化图谱。B.甲硫氨酸缺失组与补充组不同基因组区域平均甲基化水平的比较。C.人类PCSK9假定启动子区域GpC百分比的示意图。D.通过Target-BS获得的PCSK9启动子区域甲基化图谱。E-F.通过简化基因组亚硫酸盐测序RRBS获得的PCSK9基因体区域甲基化水平。图6甲硫氨酸通过DNA甲基化抑制SIRT6进而促进PCSK9 mRNA转录6饮食甲硫氨酸限制增强PD-1阻断疗法对MSS结直肠癌的疗效在机制明确的基础上研究进入临床前治疗验证。在对抗PD-1治疗原发耐药的MSS Colon 26荷瘤小鼠模型中单独使用抗PD-1抗体或DMR均有一定抑瘤效果但两者联合治疗产生了显著的协同作用极大地抑制了肿瘤生长图6A-D。免疫分析显示DMR能促进肿瘤内CD8 T细胞浸润与抗PD-1联用后效果更强图6E-G且改善T细胞效应功能图6H。更重要的是当使用抗体耗竭体内的CD8 T细胞后DMR的抗肿瘤效果完全消失图6I-J证明DMR的疗效完全依赖于CD8 T细胞。上述研究结果为通过饮食干预改善免疫治疗提供了直接证据。图7饮食甲硫氨酸限制能增强PD-1阻断MSS CRC的治疗效果7PCSK9抑制可增强PD-1治疗和5-FU化疗对MSS结直肠癌的疗效考虑到长期严格的饮食限制在临床实践中较难实施研究者探索了更可行的药物靶向策略。使用临床已批准的PCSK9单抗阿利西尤单抗。在Colon 26模型中单独抑制PCSK9或抗PD-1效果有限但两者联合治疗能显著抑制肿瘤生长并增加肿瘤内CD8 T细胞浸润图7A-D。进一步考虑到5-FU是CRC标准一线化疗团队设计了三联方案PCSK9抑制 PD-1阻断 5-FU化疗。结果显示三联疗法相比任何双药组合或单药进一步降低肿瘤负荷图7E-H。上述研究这些结果提出了两种极具转化潜力的联合治疗方案PCSK9抑制PD-1免疫治疗二联方案、PCSK9抑制PD-1免疫治疗5-FU化疗三联方案为MSS CRC患者提供精准治疗新选择。图8PCSK9抑制增强了PD-1阻断治疗和5-FU化疗对MSS CRC的效果结论和启示本研究首次揭示了肿瘤细胞利用甲硫氨酸的代谢产物SAM通过DNMT1介导的甲基化特异性地上调PCSK9从而在MSS型CRC中建立了一个独特的免疫抑制微环境。PCSK9作为一个新兴的“免疫代谢检查点”在多个层面损害抗肿瘤免疫。本研究提出的联合策略靶向PCSK9或限制其上游甲硫氨酸为克服MSS型CRC的免疫治疗耐药提供了新思路。RRBS和Target-BS在本研究中的重要作用本研究通过RRBS技术比较甲硫氨酸处理前后细胞的DNA甲基化谱揭示了甲基化水平的整体变化并初步筛选出SIRT6和FOXO3两个基因为后续机制探索指明了方向。Target-BS技术验证了RRBS结果确认了SIRT6和FOXO3特定区域的甲基化状态。其次Target-BS对PCSK9基因甲基化水平的深度检测揭示PCSK9基因体区域甲基化水平变化排除其启动子甲基化直接参与调控的可能性为理解其转录调控提供了更精细视角。关于易基因简化基因组甲基化测序RRBS研究解决方案简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为适应科研技术的需要易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)可研究更广泛区域的甲基化包括CGI shore等区域。为助力适用低起始量DNA样本5ng量多维度甲基化分析易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法extended-representation bisulfite sequencingXRBS实现了高灵敏度和微量样本复用检测使其具有高度可扩展性并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。技术优势起始量100ng gDNA单碱基分辨率多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域数据利用率更高针对性强成本较低基因组CG位点覆盖高达10-15M显著优于850K芯片。应用方向RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物要求全基因组扫描覆盖关键调控位点的队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究模式动物发育和疾病甲基化研究参考文献Wang QL, Chen Z, Lu X, Lin H, Feng H, Weng N, Chen L, Liu M, Long L, Huang L, Deng Y, Zheng K, Zheng X, Li Y, Cai T, Zheng J, Yang W. Methionine Metabolism Dictates PCSK9 Expression and Antitumor Potency of PD-1 Blockade in MSS Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Mar 24:e2501623. doi: 10.1002/advs.202501623.相关阅读1.项目文章Cell Rep:RRBS揭示MOF对UHRF1乙酰化修饰是DNA甲基化维持的关键调控机制2.项目文章RRBS揭示中药材滇重楼DNA甲基化变化及花粉调控种子休眠的表观遗传机制3.项目文章基于dRRBS技术的精液DNA甲基化年龄预测全基因组标记鉴定和模型开发4.项目文章Nature子刊RRBS等揭示IDH1-R132H突变通过DNA甲基化加剧顺铂诱导肾毒性5.项目文章泪腺RRBSRNA-seq揭示Sjögren综合征相关干眼症的潜在基因6.项目文章 | RRBS揭示基于DNA甲基化驱动基因的肾透明细胞癌预后模型的鉴定和验证7.技术推介 | 简化基因组甲基化测序研究解决方案8.DNA甲基化修饰整体研究方案DNA 5mC专题