企业官网建设流程全解析

图片外链生成工具在线,网站服务器怎么优化,网站制作设计培训多少钱,济南网络科技公司蛋白 - 蛋白互作是国自然研究中几乎所有项目均会涉及的核心内容#xff0c;以下梳理并列举 5 项相关技术#xff1a;酵母双杂交系统#xff08;Y2H#xff09;、免疫共沉淀#xff08;Co-IP#xff09;、GST pull-down、免疫荧光#xff08;IF#xff09;共定位、邻近连…蛋白 - 蛋白互作是国自然研究中几乎所有项目均会涉及的核心内容以下梳理并列举 5 项相关技术酵母双杂交系统Y2H、免疫共沉淀Co-IP、GST pull-down、免疫荧光IF共定位、邻近连接技术PLA点击。❤️在介绍上述技术前需明确以下关键注意事项不同技术的功能定位存在差异部分技术适用于靶蛋白筛选如酵母双杂交 Y2H部分适用于互作验证如邻近连接技术 PLA还有部分兼具筛选与验证双重功能如免疫共沉淀 Co-IP 联用蛋白质谱可实现筛选联用 WB 则可完成验证。因此筛选类技术一般用于预实验阶段的靶点确定验证类技术多用于明确具体分子后的功能验证。上述技术可分为细胞体系与非细胞体系In tube两类细胞体系技术更贴合生理研究背景但易受多种干预因素影响非细胞体系技术更易验证蛋白间直接互作但难以完全还原体内真实场景且对蛋白纯化操作要求更高。为确保研究结论的严谨性蛋白 - 蛋白互作验证需同时结合细胞与非细胞体系开展。上述技术在国自然项目设计中存在 “必备项” 与 “加分项” 之分观点仅供参考无需在方案中全面罗列应结合研究需求合理选择。一、酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid SystemY2H核心用于目的蛋白结合靶蛋白的筛选国自然中为可选技术真核生物转录激活因子普遍具备两个独立结构域DNA 结合域BD与转录激活域AD。二者单独存在时无转录激活活性仅当空间上发生靠近方可重组为具有活性的转录激活因子进而启动下游基因转录。操作步骤如下构建融合蛋白将目标蛋白蛋白 X与 BD 融合形成 “诱饵”将待筛蛋白蛋白 Y与 AD 融合形成 “猎物”。转化酵母细胞将编码两种融合蛋白的基因分别导入酵母细胞。互作介导重组若蛋白 X 与蛋白 Y 在酵母细胞内发生互作其融合蛋白可使 BD 与 AD 靠近重组为活性转录激活因子。结果判定活性转录激活因子会驱动报告基因如 HIS3、lacZ 等表达通过检测报告基因活性即可判断蛋白间是否存在互作。二、免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation, Co-IP兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能国自然必需技术免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation, Co-IP以抗体与抗原的特异性结合为核心原理用于解析蛋白间相互作用。细胞在非变性条件下裂解时蛋白间的生理性互作状态可得以保留利用靶蛋白特异性抗体进行沉淀时与之结合的互作蛋白会随靶蛋白共同被捕获。操作步骤如下细胞处理收集细胞并进行裂解裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以抑制蛋白降解。上清获取细胞裂解后离心去除沉淀的细胞碎片收集含可溶性蛋白的上清液。免疫结合加入靶蛋白特异性抗体及蛋白 A/G 偶联磁珠或琼脂糖珠于 4°C 孵育以实现抗体与靶蛋白的特异性结合。复合物捕获孵育结束后离心收集结合有蛋白复合物的珠子弃去未结合的游离蛋白。非特异洗脱用裂解缓冲液多次洗涤珠子去除非特异性结合的杂蛋白。复合物释放加入蛋白样品缓冲液并煮沸珠子使结合的蛋白复合物从抗体 - 珠子复合物上释放。结果分析通过 SDS-PAGE 电泳分离蛋白复合物再结合 Western blotting验证已知互作蛋白或质谱分析筛选未知互作蛋白进行结果解读。三、GST 下拉实验GST pull-down兼具靶蛋白筛选与蛋白 - 蛋白互作验证功能国自然一般必需技术GST pull-down 以谷胱甘肽 S - 转移酶GST与谷胱甘肽GSH的高亲和力结合为核心原理将 GST 融合蛋白固化于谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上作为 “诱饵”用于捕获体系中与之发生相互作用的 “猎物蛋白”该方法多用于体外蛋白互作的检测与验证。操作步骤如下构建携带 GST 标签的融合蛋白表达载体转染至原核或真核表达系统中进行蛋白表达。收集表达菌株或细胞并完成裂解操作裂解液中需添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白降解。将细胞裂解物与固化有 GST 标签蛋白或 GST 融合蛋白的琼脂糖珠充分混合置于 4℃条件下孵育数小时。离心收集结合蛋白复合物的琼脂糖珠弃去未发生结合的游离蛋白组分。选用适配缓冲液对琼脂糖珠进行多次洗涤去除非特异性结合的杂蛋白。向沉淀的琼脂糖珠中加入蛋白样品缓冲液并煮沸洗脱结合的蛋白复合物。通过 SDS-PAGE 电泳对洗脱的蛋白复合物进行分离结合 Western blot 技术验证已知互作蛋白或借助质谱分析筛选未知互作蛋白。四、免疫荧光共定位ImmunoFluorescence Colocalization通过蛋白亚细胞共定位结果佐证蛋白 - 蛋白互作关系国自然一般必需技术免疫荧光共定位技术是解析细胞内蛋白互作的可视化手段其核心原理为利用两种不同发射波长的荧光标签如绿色荧光蛋白 GFP、红色荧光蛋白 DsRed分别标记两种目标蛋白借助荧光显微镜观察二者在细胞内的空间分布是否重叠进而为蛋白间的相互作用提供直观证据。操作步骤如下构建目标蛋白与不同荧光蛋白的融合表达载体转染至宿主细胞中实现蛋白表达。待细胞培养至适宜密度后采用固定液对细胞进行固定处理维持细胞形态与蛋白定位。依据实验需求选用特异性荧光抗体对靶蛋白进行免疫标记若为荧光蛋白融合表达则可省略此步。利用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察采集荧光信号图像。运用图像分析软件处理采集到的图像计算共定位系数对两种蛋白的共定位程度进行定量评估。五、邻近连接技术Proximity Ligation AssayPLA核心用于蛋白 - 蛋白互作验证国自然设计中可作为加分项邻近连接技术PLA是一类兼具检测与定量功能的蛋白分析技术可用于验证蛋白 - 蛋白互作、检测蛋白表达水平及解析翻译后修饰如磷酸化、乙酰化、糖基化等。其核心原理为采用一对携带寡核苷酸标签的 PLA 探针偶联寡核苷酸的二抗当两种探针分别结合靶蛋白后若靶蛋白存在互作则探针间距会处于临界近距离此时探针上的寡核苷酸可在连接酶作用下形成闭环 DNA 模板通过滚环扩增RCA技术实现信号级联放大后最终以荧光或显色方式完成可视化检测。操作步骤如下样本制备对细胞或组织样本进行固定及透化处理确保探针可有效结合靶蛋白。封闭处理对样本进行封闭以阻断非特异性结合位点降低背景干扰。一抗孵育加入两种特异性一抗分别与两种靶蛋白的不同表位特异性结合。PLA 探针孵育加入两种 PLA 探针带寡核苷酸标签的二抗使其与对应的一抗特异性结合。连接反应若两种靶蛋白存在互作结合的 PLA 探针会充分靠近此时连接酶可将探针上的寡核苷酸连接形成环状 DNA 模板。滚环扩增采用 RCA 技术对环状 DNA 模板进行扩增生成大量串联重复的 DNA 产物实现信号放大。检测分析加入荧光标记的探针与扩增产物结合通过荧光显微镜观察荧光信号同时完成定性判断与定量分析。原文点击以蛋白研究之名揭秘看得见的蛋白互作技术